一、EHP简介
Enterocytozoon hepatopenaei（EHP）是一种微孢子，专性细胞内生长的孢子寄生虫，微孢子门几乎可以感染所有无脊椎动物和脊椎动物，以及一些原生生物，但是不同的微孢子门表现出不同程度的宿主特异性，目前大多人都认为他们是一种真菌，已经发现大约200个属和1400个物种。
其中，Enterocytozoon hepatopenaei（EHP），首次在泰国的斑节对虾身上发现，EHP主要感染虾胃肠。尽管EHP并不是虾的致命病原体，但实际上，它可以虾塘中水平传播，并严重响了虾的生长，已经给虾农带来巨大的经济损失。目前，EHP也已报道在其他一些国家当中出现，如中国，越南，文莱，马来西亚，印度尼西亚，印度和委内瑞拉。
人类中大多数微孢子虫感染是人畜共患或水传播的，并且会感染免疫差或者有免疫缺陷的人，尽管没有证据表明EHP会感染除虾以外的其他动物，但是对于人类健康而言，检测虾是否感染EHP也极为重要。由于虾感染EHP在短的时间内没有明显的临床症状，造成健康虾必须与EHP病虾“同居”，给养虾造成巨大的灾难。因此，有必要开发一种有效的方法来检测被EHP感染的虾，特别是在感染的早期。目前，EHP的检测方法主要是通过显微镜检测和分子诊断的方法。
显微镜检测方法：EHP孢子通过卡尔科弗卢尔荧光染色剂（CFW），检测出?虾是否感染EHP。但是，显微镜检查主要取决于技术人员对专业技能掌握以及主观判断，?再加上显微镜的灵敏度和特异性太有限，所以可能会误判结果。
分子诊断方法：此外，针对EHP感染的虾检测，还有例如PCR，qPCR，巢式PCR(nested PCR)，环介导的等温扩增反应（LAMP）等，已经很多报道证明了这些分子诊断具有更高的敏感性和特异性。其中，核糖体RNA（ribosomal RNA,rRNA）是EHP分子检测方法中的通用诊断靶点。但是众所周知，SSU rRNA基因在微孢子虫中高度保守，可能会给出假阳性的检测结果。因此，需要选择更具体的诊断靶点，而不是SSU rRNA。
极管是微孢子虫的重要分类学指标之一，是一种高度特化的入侵器官。到目前为止，已有5个极性管蛋白(PTP1-PTP5)位于被发现在极性管上。在微孢子虫中首次发现编码35kda蛋白的PTP2基因。该基因也在其他一些微孢子虫基因组中被发现，包括encinalis、enc.hellem、Paranosema grylli、Nosema ceranae、N. bombycis等。也有报道称，在EHP基因组中，PTP2基因是一个单拷贝，由于这些独特的特性，PTP2被选作重组酶聚合酶扩增（RPA）和CRISPR-Cas 12a荧光测定的EHP检测靶标。
但是，这种新开发的方法无法定量虾中EHP的孢子数。为了提供更灵敏和特异的EHP定量方法，我们建立了基于PTP2的SYBR Green I荧光定量PCR方法本研究中的基因序列。本研究建立了基于PTP2基因序列的SYBR Green I荧光定量PCR方法。此外，为了在现场提供EHP的实时监控，我们尝试使用显微镜对EHP孢子进行定量。
因此此次研究，是我们首次报道了定量PCR和显微镜技术定量EHP孢子的集成方法，这将为虾类养殖中EHP的检测提供科学参考。
二、材料和方法
2.1.样品处理和Dna提取我们从中国重庆采集虾虾样本，将30mg肝胰腺组织用于基因组DNA提取。
2.2.引物的合成和常规PCR扩增通过PCR扩增EHP的EHP-PTP2基因（GenBank编号MT249228），SSU rRNA基因（GenBank编号FJ496359.1）和β-Tubulin基因（GenBank编号KY593130），以确认虾确实感染了EHP。
表1. 本研究中的引物序列。
2.3.标准样品的构建将部分EHP-PTP2序列的扩增DNA片段（238bp）插入pMD19-T载体中，并转化到大肠杆菌 DH5α中。
2.4。反应体系的优化在优化的反应系统中，EHP-PTP2-F和EHP-PTP2-R引物的终浓度为0.2μM（表2）。
表2. PTP2-qPCR的反应系统（10μL）。
2.5.标准曲线的生成将标准质粒稀释至1.0×107copies/mol/L，制作7个梯度的10倍系列（1.0×107 –1.0×101copies/mol/L）。
2.6.特异性分析为了分析PTP2-qPCR的特异性，感染了不同虾病原体（例如白斑综合症病毒（WSSV），虾血细胞虹彩病毒（SHIV）以及副溶血弧菌（VP AHPND））的南美白对虾,总DNA以肝胰腺坏死病为模板进行qPCR扩增。健康的南美白对虾的DNA用作阴性对照的模板，感染了EHP的南美白对虾的DNA作为阳性对照的模板。
2.7.敏感性分析为确定PTP2-qPCR的敏感性，采用连续稀释的阳性质粒DNA(1.0×105-1.0×101 copies/ pcr)作为qPCR模板，水作为阴性对照。当曲线仍呈s形扩增时，所能检测到的最高稀释倍数即为qPCR最低模板拷贝浓度。常规PCR也做同样的测试，琼脂糖凝胶上能形成可见条带的最高稀释倍数等于PCR最低模板拷贝浓度。
2.8.重复性分析为了分析PTP2-qPCR的可重复性，三名不同的实验人员进行了qPCR检测，将五例EHP感染的南美白对虾用作qPCR样品，并计算标准偏差和变异系数。
2.9.显微镜分析用荧光显微镜观察EHP孢子，并随机记录20个孢子数。
三、研究结果
3.1.qPCR标准曲线使用优化的反应系统建立与标准模板拷贝数的Cq值相对应的标准曲线。当x在1.0×10 1至1.0×107copies/mol/L范围内时，扩增定量（Cq）与初始模板量（x）的对数之间的对应关系显示出良好的线性相关性：Cq=-3.2751 x + 31.269，相关系数R 2=0.993，放大效率为102％。从图1所示的扩增曲线在整个扩增过程中，在81°C处有一个良好的梯度和一个独特的熔解峰，表明扩增产物是均匀的。
图1. 标准样品的扩增。
3.2.特异性分析使用EHP和其他虾病原体（包括WSSV，SHIV，VP AHPND）分析了PTP2-qPCR方法的特异性。仅EHP阳性模板显示出明显的扩增曲线，而其他模板中不存在荧光信号，表明该定量方法具有良好的特异性（图2）。
图2. PTP2-qPCR的特异性扩增曲线。
3.3.敏感性分析在有效Cq范围内具有典型的S形曲线时，通过PTP2-qPCR检测到的最低模板拷贝浓度为1.0×101copies/ mol/L（图3a）。使用常规PCR，当模板低于1.0×103copies/ mol/L，很难用肉眼分辨扩增片段（图3b）。表明PTP2-qPCR的灵敏度比常规PCR高至少两个数量级。
图3. 标准模板的敏感性测试。
3.4.重复性分析由三名不同的实验人员，通过Cq值计算出标准偏差（SD）和变异系数（CV）。结果表明，这三个不同实验人员的Cq值基本一致。同时，CV<1％，表明PTP2-qPCR的重复性可靠（表3）。
表3. PTP2-qPCR的变异系数（CV）分析。
3.5.虾场中集成的PTP2-qPCR和显微镜分析EHP用荧光增白剂28染色后，从被EHP感染的虾中观察到许多椭圆形的孢子，大小在1-2μm之间，而正常虾样品中没有荧光信号（图4）。在通过整合染色和PTP2-qPCR方法分析同一EHP感染的样品期间，孢子数与PTP2基因的拷贝浓度之间存在简单的对应关系（表4）。
当EHP浓度时，显微镜很难观察到EHP孢子.但是，随着EHP浓度的数量级增加，一个区域中的孢子数量也有规律地增加。因此，当虾受到严重感染时，可以通过显微镜检查根据孢子数快速预测EHP浓度。
图4. 虾样品肝胰腺中EHP孢子的染色分析。
表4. 用于EHP定量的显微镜和PTP2-qPCR的综合分析。
四、关于微孢子虫讨论
微孢子虫已经研究了150多年，可以感染多种动物（从无脊椎动物到脊椎动物）。EHP主要寄生于肝胰腺和虾的肠道，导致宿主的生长缓慢。由于EHP早期不会引起虾的出现明显的病理症状，因此养殖户很难迅速发现这种病原体。对于EHP检测，一些显微镜检查方法虽然操作简单，并且被广泛使用。但是，灵敏度低，准确性低，尤其是显微镜检查很难检测到被EHP感染的虾，特别是在早期感染中。
因此，已开发出高灵敏度的分子诊断技术，例如PCR，qPCR和环介导的等温扩增（LAMP），以取代显微镜方法。SSU rRNA的基因，是EHP分子诊断共同的靶标，但具有高度保守性，是有可能产生假阳性结果。因此，在我们的研究中选择了一个特定的靶标以建立用于EHP检测的SYBR Green I荧光定量PCR方法。
根据最新研究，PTP2基因在重组酶聚合酶扩增（RPA）和CRISPR-Cas 12a荧光检测中显示出良好的检测目标。实际上，EHP浓度是虾类养殖的关键参数，在这项研究中，针对PTP2通过实时定量PCR建立了SYBRGreen I荧光基因检测EHP，在最低拷贝浓度下，表现出该诊断具有较高的敏感性。此外，在我们的研究中未证实与其他虾病原体发生干扰反应（图2），这表明该PTP2-qPCR方法具有良好的特异性。
最重要的是，将PTP2-qPCR方法，可以用于EHP感染的早期检测，这对于养殖户提早发现EHP，是具有很大的帮助的，因此，这种综合的方法可以为整个虾类养殖期间提供全面的EHP检测服务，并为EHP的流行病学研究提供参考。
五、研究结论
据我们所知，这项研究是目前世界上用于EHP检测当中，第一个整合的qPCR和染色显微镜技术。在虾类养殖中，当EHP感染严重时，可以通过显微镜直接检测，而当EHP感染较轻时，可以通过qPCR检测。两种方法的结合，不仅可以使测试结果更加准确，而且可以及时有效地预防和控制EHP。
另外，我们建议将PTP2-qPCR综合方法用于研究食物链中的EHP传播途径，以监测食物链的安全性。